تکنیکهای تشخیصی بیماری تیلریوز

تیلریا انگل تک یاخته أی اجباری داخل سلولی تمام خانواده گاوهای وحشی و اهلی ( Bovidae ) در جهان میباشد. و بعضی از گونه ها نشخوارکنندگان کوچک را نیز مبتلا می نماید. بوسیله کنه های خانواده Ixodidae منتقل میشوند و دارای زندگی پیچیده ای در مهره داران و بی مهره ها میباشند. شش گونه تیلریا گاو را آلوده میکند که دو تا از آنها بیماری زایی بیشتری دارند : اولی بنامT. parva که بیماری East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ایجاد و دومی T. annulata باعث بیماری Tropical theileriosis میشود.

دیگر گونه ها که شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans هستند معمولا بیماری زایی خفیفی ایجاد میکنند. گونه T. velifera غیر بیماری زا است. اغلب این گونه ها پس آلوده کردن دام ایجاد دام ناقل در دامهای بهبود یافته را مینمایند اما هیچ نوع داده وآماری در رابطه با رل این ناقلین در انتقال بیماری در حالت طبیعی وجود ندارد.

گاوهای بومی درمناطق بومی آلوده ممکن است بیماری را تحمل نموده و یا به بیماری خفیف و تحت کلینیکی مبتلا شوند. اما گاوهای غیر بومی حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شدیدی نشان داده و یا تلف می شوند.

همانطوریکه قبلا هم گفته شد شیزونت ها در گسترش تهیه شده از غدد لنفاوی مشخصه خوبی برای آلودگی با T. parva, T. annulata میباشد. شیزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آمیزی شده بوسیله گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمیباشد.

شیزونت T.mutans نسبت به شیزونت T. parva دارای هسته های بزرگتر، مسطح وبی قاعده میباشد.

فرم پیروپلاسمی T. parva , T. annulata و T. mutans شبیه بهم میباشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسیم دیده میشود. T. velifera ممکن است بوسیله یک پرده حجاب مانند تشخیص داده شود.

تشخیص سرولوژیکی :

تشخیص وجود پادتن بصورت غیر مستقیم بوسیله IFA ( indirect fluorescent antibody)

بطور گسترده برای تشخیص گونه های مختلف تیلریا بکار می رود. تشخیص نوع آلودگی بخصوص آلودگی با T. parva چندان در بین روشهای ایمنولوژی قابل تمایز نمی باشد. بهترین روش سرولوژی قابل تمایز مابین گونه های تیلریا آزمایش غیر مستقیم پادتن فلورسانس IFA ( Indirect Fluorescent Antibody ) می باشد. در این آزمایش هر دو مرحله شیزونت و پیروپلاسمی بوسیله لام تهیه شده و یا در محلول قابل بررسی می باشند. برای نگهداری محلول یا لامهای تهیه شده در مرحله شیزونتی دمای انجماد (20- تا 70- ) استفاده میشود ولی در مرحله پیروپلاسمی برای نگهداری محلول از دمای 4 درجه یخچال و برای لامها از دمای انجماد میتوان استفاده کرد.

سرمهای مورد آزمایش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقیق میکنند و با محلول آنتی ژنی در انکوباتور میگذارند و بعد ضد ایمنوگلوبولین متصل گاوی anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده میشود.

الف- تهیه لام یا اسلاید آنتی ژن شیزونت

آنتی ژن مورد استفاده برای schizont IFA test ازتیره سلولی شیزونت لیمفوبلاستوئید Lymphoblastoid گرفته میشود. کشتهای سلولی را که دارای رقت 200 میلی لیتر شیزونت در یک لیتر شیزونت های آلوده ( به T. parva ویا T. annulata بوده و حاوی ده میلیون سلول در هر میلی لیتر و حداقل 90% سلولها آلوده میباشند ) باشد را سانتریفیوژ کرده ( بمدت 20 دقیقه در سرعت 200 دور در دقیقه در دمای 4 درجه ) و مایع روئی را دور ریخته و سلولهای ته نشین شده را با 100 میلی لیتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دمای 4 درجه و pH 7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتریفیوژ میکنیم. این روش شستشو را سه بار تکرار کرده و در آخرین با رسلولهای ته نشین شده را با 100 میلی لیتر PBS مخلوط کرده تا غلظت نهائی حدودCELL/ML 7 10 درآید.

گسترش نازک از محلول سلولی را روی اسلاید حفره دار ( از جنس تفلن ) تهیه کرده ویا روی لام معمولی را با استفاده از لاک ناخن تقسیم کنیم . هر گسترش باید دارای 50 تا 80 سلول سالم در هر دید میکروسکوپی Field باشد ( وقتیکه با بزرگنمایی 40 با روغن Immersion بررسی شود) .بوسیله پی پت 100μl آنتی ژنها را با مکش یکدفعه روی لام ریخته که پس از توزیع محلول شیزنت یا پیروپلاسم یک لایه Monolayer در هر کدام باقی می ماند. اینکار را برای هر حفره انجام داده تا مایع تمام شود. بااین روش تقریبا“ می توان 600لام با کیفیت خوب که حاوی 6 هزار سلول در هر نقطه آنتی ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشک کرده ودراستن بمدت ده دقیقه ثابت کرده ( Fixation) وبطور جداگانه دردستمال کاغذی پیچیده و سپس در کاغذ آلومینیم ( فویل آلومینیم ) وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردمای20- درجه سانتیگرادیا 70 - درجه سانتیگراد نگه می داریم . دردمای –20 درجه سانتیگراد بمدت یکسال قابل استفاده هستند ودردرمای –70 درجه سانتیگراد بمدت طولانی تر ( دردمای یخچال 4 درجه سانتیگراد بمدت چهارماه قابل نگهداری هستند).

ب- محلول آنتی ژن شیزونت

ابتدا 500 میلی لیتر از محلول T.annalataیا T. parva سلولهای آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانترفیوژکرده ( در 150 g دور دردقیقه برای ده دقیقه در دمای 4 درجه ) وسلولهای ته نشین شده در100سی سیPBS سرد دوبار شستشو می دهیم.

قابلیت زنده بودن سلولها را بوسیله اوزین Eosin یا Trypan blue بررسی میشود ( که باید بیش از %90 باشد ) محلول سلولها باید درمحلول سرم فیریولوژی سرد رقیق شود تا غلظت 7 10سلول (/ml Cell) بدست آید دراین حجم ، دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوی 80% استن و 0.1 % فرمالین در PBS قطره قطره اضافه کرده ( در درمای –20 درجه ) تا درمدت 24 ساعت به تثبیت رسد.

سلولهای ثابت شده را سه بار شستشو داده ( در سرم فیولوژی سرد شده دردمای 4 درجه ) و در 200 دور دردقیقه بمدت 20 دقیقه سانترفیوژ میکنیم. بعد از آخرین شتشو سلولهای ته نشین شده را در سرم فیولوژی رقیق کرده تا غلظت 107/ml بدست آید . بمیزان 5/0 سی سی سلولهای ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسیم می کنیم .

تهیه اسلاید حاوی آنتی ژن پیروپلاسم:

مرحله پیرپلاسمی گونه های تیلریا را نمی توان درکشت سلول نگهداری یا تهیه نمایند. زیرا آنتی ژن پیروپلاسمی باید از حیوانات زنده آلوده تهیه شود و عفونتهای تجربی بوسیله تزریق زیر پوستی با اسپروزئیت یا کنه های آلوده باT.parva T.taurotragi ,T.annulata , صورت میگیرد. آلودگی گروه انگلی T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسیله تزریق داخل رگی خون حیوان ناقل به گاو یا گوساله طحال برداشته و یا تماس با کنه آلوده ایجاد می شود. وقتیکه آلودگی پیروپلاسمی بیش از 5% باشد، صد میلی لیتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبی با PBS مخلوط می کنیم . این مخلوط را سانترفیوژ کرده ( با500دور در دقیقه برای ده دقیقه) و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا کرده و RBC های باقی مانده را بادولیتر PBS رقیق می کنیم. سپس دوباره سانترفیوژ کرده وهمینطور Buffy coat را جدا میکنیم . این عمل رابرای چهار بار تکرار می کنیم و بعد از پنجمین ششتشو، مقداری از RBC های جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط کرده واز آن 5μl روی هر اسلاید می گذاریم. نقاط خشک شده را با متانول تثبیت کرده وبا رنگ آمیزی گیمسا رنگ میکنیم ونهایتا زیرمیکروسکوپ نوری بررسی می کنیم . تقریبا ده هزار اسلاید آنتی ژنی ( صد هزار نقاط آنتی ژن ) ا ز100سی سی خون آلوده تهیه می شود. اسمیرهای آنتی ژنی را در دمای اتاق خشک کرده وبعد در دمای 4 سانتیگراد درجه در استن بمدت ده دقیقه فیکس میکنیم. اسمیرهای فیکس شده شبیه اسلایدهای آنتی ژنی شیزونت نگهداری میشوند.

محلول یا سوسپانسیون حاوی پیروپلاسم :

یک روش تهیه آنتی ژن برای T.parva قبلا“ شرح داده شد دراین روش صد میلی لیتر از خون حیوانیکه شدیدا“ در مرحله آلودگی پیروپلاسمی باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهای قرمز تجمع کرده را به PBS اضافه کرده تا محلول 5% بدست آید.- در مراحل فوق باید آنتی ژن را استانداردکرد-

تهیه lysate Bovine Lymphocyte : این ماده طبق روش Godderis et al. برای بررسی محلول آنتی ژن T. parva بکار می رود . ابتدا یک گوساله سه ماهه که طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طریق تماس با کنه و یا پشه تسه تسهtse Tse آلوده می کنیم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آمیزی گیمسا بررسی میکنیم . نهایتا بعد از مرگ یا کشتن حیوان از تیموس و غددلنفاوی نمونه برداری می کنیم .

بافتها را به قطعات کوچکتر تقسیم کرده ودر PBS سرد ( در دمای 4 درجه) بهمراه %45 /.0 مواد ضد انعقاد نگهداری میکنیم . سلولها را از بافت بوسیله پارچه MUSLIN جدا کرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTA میدهیم و در دور 200 بمدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ میکنیم . لینفوسیتهای شسته شده را با PBS که عاری از EDTA باشد، مخلوط می کنیم تا غلظت نهائی CELL/ML 107*5 بدست آید .

روش کار برای تشخیص آنتی بادی فلورسانس :

اسلاید شیزونت یا پیروپلاسم را از دمای انجماد، 20- درجه سانتیگراد در آورده و بمدت 30 دقیقه در دمای یخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقیقه دیگر در دمای اتاق میگذاریم.

بوسیله پی پت پاستور 100/μl آنتی ژن را روی هر لام ریخته ودردمای اتاق 37 درجه خشک می کنیم . میتوان برای تلعلع بهتر ودید بهتر از Evansblue نیزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده کرد و بعد در گلسیرول 50% در pH 8 میگذاریم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولانی تر و عمیق تر اثر گذارد . اسلایدهای تهیه شده تا 72 ساعت در دمای 4 درجه د رتاریکی قابل نگهداری و استفاده میباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئیت ها آنتی بادی های تولید شده بر علیه T.parva و T.annulate ابتدا" بین روزهای دهم تا 14 برعلیه شیزونت ودر بین روزهای 15-21 بر علیه پیروپلاسم قابل تشخیص می باشند. پادتنها بعد از بهبودی ناپدید می شوند ووابسته به فاکتورهای متفاوتی از جمله وضعیت ناقل، فاصله مابین درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با کنه آلوده تغییر می کنند. معمولا“ 4 تا 6 ماه بعد از آلودگی آنتی بادی پائین می آید ( در صورتیکه تماس دوباره پیش نیاید).

بدنبال آلودگی با T.mutans آنتی بادی در روزهای دهم تا 15 قابل اندازه گیری بوده و بعد از 12-24 ماه پائین میآید.  

برگرفته از:http://www.vet.mihanblog.com